3讨论

近年来，针对分枝杆菌的研究以宿主导向治疗（HDT）为核心的免疫治疗策略为主。HDT不仅可以对耐药菌和敏感菌治疗有效，而且避免了细菌耐药性的产生，可以缩短抗生素治疗周期。COSTA等建议将HO-1作为HDT治疗结核病的潜在靶点。说明HO-1具有潜在的治疗价值。本研究结果发现，HO-1过表达能够有效抑制M.abs诱导的自噬相关蛋白ATG5、LC3Ⅱ表达，p62表达增加，对溶酶体荧光值影响较小。抑制HO-1酶活性能有效增强ATG5、LC3Ⅱ表达，p62表达减少，溶酶体荧光值增加。说明抑制HO-1能有效增强自噬流的发生，有利于清除细胞内M.abs。

HO-1表达变化对胞内菌生长具有重要影响。本研究发现M.abs在感染过程中HO-1蛋白表达先增加，随着感染复数增加或感染时间延长，HO-1蛋白表达有下降趋势。一方面，M.abs感染早期，HO-1表达增加有助于M.abs胞内增殖，可能与HO-1催化产物亚铁离子为细菌生长提供了营养物质有关，或者可能与HO-1表达增加抑制了细胞凋亡，为细菌胞内存活提供有利环境有关。此外，HO-1过表达产生大量游离亚铁离子可引起铁死亡，导致分枝杆菌在细胞中传播。由此可见，HO-1表达增加不利于宿主对胞内菌的清除。另一方面，随着M.abs感染时间的延长，HO-1蛋白表达有降低趋势，可能与M.abs感染后期，宿主抑制HO-1表达，增强自身自噬活性，清除胞内M.abs及减轻细胞炎症反应有关。

自噬增强对病原体胞内清除具有重要的作用。自噬参与固有免疫反应和适应性免疫反应，是机体清除自身有害的成分，维持自身稳态的一种调节方式。近年来，有文献报道自噬增强可以有效控制胞内病原体，并且已有自噬选择性治疗药物相关报道。一般情况下，p62被认为是自噬流的标志物，其通过与LC3相互作用锚定于吞噬体上，并在自噬活化过程中通过自噬溶酶体途径不断被降解。因此，p62表达量反映了自噬活化强弱。自噬相关蛋白Atg5是LC3Ⅰ向LC3Ⅱ蛋白转换以及使LC3Ⅱ蛋白锚定于自噬体的关键蛋白。Atg5减少说明其转化作用受抑制，从而使LC3Ⅱ表达减少，自噬体形成减少，p62体内聚集，抑制自噬。这说明Atg5是控制自噬强弱的关键蛋白，它可影响整个自噬功能的结局。本研究结果揭示，M.abs诱导自噬相关蛋白ATG5、LC3Ⅱ增加，说明M.abs可诱导自噬小体形成，然而p62并没有减少，反而增多，说明M.abs抑制自噬溶酶体降解，阻断了M.abs胞内清除，与KIM等的研究结果相似。此外，自噬流标志物p62和HO-1之间有密切的联系。KATSURAGI等研究发现p62磷酸化可增强p62与Keap1之间的亲和力，促使Nrf2与Keap1复合物分离并转入细胞核，导致Nrf2相关性抗氧化蛋白HO-1的表达增加，p62与Keap1随后通过自噬途径被降解。本研究发现HO-1诱导剂CoPP预处理后，HO-1和p62表达显著升高，HO-1表达增加可能与p62与Nrf2竞争性结合Keap1，促使Nrf2入核诱导HO-1表达有关，但本研究没有发现p62表达减少现象，可能与自噬被抑制有关。此外，本研究通过采用HO-1诱导剂CoPP和酶抑制剂SnPP预处理发现，HO-1有效调控Atg5表达，对p62和LC3Ⅱ表达结果与KIM等采用Atg5 siRNA干扰结果一致。因此，本研究结果说明HO-1至少可以通过调节Atg5进行自噬小体调控。进一步用LysoTracker Red染色发现SnPP抑制HO-1能显著增加细胞溶酶体酸性区室荧光。采用早期自噬抑制剂3-MA和晚期自噬抑制剂BafA1均显著减少溶酶体红色荧光，说明抑制HO-1能动员更多溶酶体参与自噬活化。

值得一提的是，本研究胞内菌落计数实验结果发现，CoPP预处理组与单独M.abs组差异无统计学意义。SnPP预处理细胞3 h后加入M.abs共孵育24 h，菌落计数没有明显减少。然而SnPP预处理细胞12 h后加入M.abs共孵育48 h，显著抑制胞内细菌生长和细胞因子TNF-α表达。TNF-α表达结果与SCHARN等研究结果相似，可能与自噬增强清除病原菌导致炎症减轻有关。一般而言，炎症、自噬和细菌胞内存活三者之间有着密切的联系。胞内细菌能导致自噬增强和炎症产生，而自噬精准调控病原体引起的炎症反应，主要有以下3种形式：①自噬通过清除病原体，进而抑制炎症反应；②自噬可以降解炎症小体调控炎症或直接下调炎症因子；③自噬能够通过调控免疫细胞的细胞器功能间接调控炎症因子产生。因此，自噬对病原体及炎症的调节起到重要的作用。研究抑制HO-1为靶标的药物可能对抑制M.abs胞内活性具有潜在的临床应用价值。已有文献报道非编码单链RNA分子模拟物通过抑制HO-1表达实现炎症调节和胞内菌清除。下一步，本研究将通过数据库对以HO-1为靶点进行microRNA预测并筛选，为将来靶向药物的临床试验提供科学依据。

综上所述，本研究发现HO-1有效调控M.abs诱导的自噬流发生，并且HO-1抑制剂SnPP通过增强细胞自噬活性，有效抑制M.abs胞内存活及炎症反应。为下阶段以抑制HO-1为靶向的免疫治疗药物筛查提供科学的理论依据。